Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte
   
  Engenharia Genética
  Diagnóstico Molecular e Biotecnologia Molecular
 

As doenças genéticas têm vindo a ser alvo de cada vez mais atenção pois a sua presença na realidade da população tem sido acentuada. Com o aumento da esperança média de vida, novas doenças vão surgindo, sendo necessário desenvolver meios para as diagnosticar e futuramente tratar. Os avanços sofridos pela biotecnologia molecular têm permitido efectuar diagnósticos de diversas doenças, baseando-se geralmente em dois métodos, Hibridação e PCR.

 

  Hibridação

 

ASOs (Allele Specific Oligonucleotids) dot-blot

 

Neste caso, é possível diagnosticar a doença se as sequências do alelo normal e do mutado forem conhecidas. O DNA é fixo, (aplica-se numa membrana) e as sondas são móveis. Efectua-se dois testes em paralelo, um usando uma sonda que híbrida com o alelo normal e outro usando uma sonda que híbrida com o alelo mutado. Os indivíduos que tiverem positivo só para o primeiro teste têm os dois alelos normais, os que tiverem para o segundo têm os dois alelos mutados e os que tiverem positivo para ambos possuem um alelo normal e um mutado.

  

Detecção de RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
 

Uma mutação cria ou elimina um certo local de restrição e ao efectuar a digestão enzimática seguida de electroforese, o indivíduo que possuir o gene mutado terá mais ou menos um fragmento, respectivamente. A mutação poderá ainda alterar a zona do local de restrição obtendo-se fragmentos com tamanho diferente do normal.

        
                
Detecção de VNTRs (Variable Number Tandem Repeats)

O tamanho das sequências repetitivas contíguas entre dois locais de restrição varia conforme uma certa mutação. O procedimento neste caso é similar ao anterior mas na análise o objectivo é verificar o tamanho dos fragmentos.
       


PCR

 

Detecção de RSP (Restriction Site Polymorphism)

 

Os primers utilizados são complementares às regiões flaqueantes do local de restrição polimórfico. Promove-se uma reacção normal de PCR e os fragmentos obtidos são digeridos com a enzima de restrição que corta nesse local polimórfico. Analisa-se os fragmentos por electroforese.

            
 

Detecção de STRPs (Short Tandem Repeat Polymorphisms)

 

Uma vez mais, os primers utilizados são flaqueantes neste caso, às regiões de DNA repetitivo. Após a reacção de PCR é possível determinar o tamanho das sequências repetitivas por electroforese.

 PCR especifica de alelo
 

A reacção de PCR ocorre com três primers. Um especifico para o alelo mutado (1), outro especifico para o alelo selvagem (2) e outro especifico para um região conservada e comum aos dois (3). Se o DNA do indivíduo possuir a mutação haverá produto amplificado com o primer 1 e 3, identificando-se a presença da mutação.

 

Detecção de SSCPs (Single Strand Conformation Polymorphisms)

 

Neste caso é possível verificar se uma pessoa tem certa mutação pois cadeias simples de DNA que difiram nem que seja numa só base, terão conformidades diferentes e consequentemente corridas de electroforese distintas. Desemparelhando o DNA e promovendo uma electroforese é possível identificar um indivíduo que possua a mutação.
              

Com os conhecimentos adquiridos por todas estas técnicas, surge a tentativa de remediar o que se identificou de errado. Neste passo e engenharia genética está uma vez mais presente. As terapias moleculares como a terapia génica e enzimática, estão também em ascensão. Introdução do gene não mutado ou da enzima em falta, assim como substituição da base mutada pela base normal, são tentativas que têm vindo a ser experimentadas e que concerteza no futuro terão grande aplicabilidade.

 
  ENGENHARIA GENÉTICA  
 
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Disciplina de Biotecnologia