Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte
   
  Engenharia Genética
  Tecnologia de Análise de Ácidos Nucleicos e Expressão Genética
 

Muitas vezes, em Engenharia Genética pretende-se fazer um estudo da expressão dos componentes
genéticos, a nível da transcrição ou tradução a fim de entender a regulação e interacção proteica existente para depois a manipular e melhorar. A tecnologia geralmente descrita para analisar a expressão genética é o Northern Blot ou Real Time - PCR, abordadas anteriormente. Porém, existe um extenso número de métodos sensíveis e úteis que se podem aplicar conforme o objectivo do estudo.
 


Genes repórter

Os genes repórter permitem visualizar o seu produto de expressão (produtos fluorescentes ou corados) e têm uma série de características que favorecem a sua função como ausência de produção endógena, proteína sintetizada sem interacção fisiológica na célula hospedeira e actividade proteica medida simples, rápida e sensivelmente. Basicamente, o gene que se pretende estudar é substituído pelo gene repórter, intencionalmente. Assim, se se visualizar o produto de expressão do gene repórter, indica que a zona estudada é importante para a expressão do gene em estudo e vice-versa, sendo a quantidade de produto repórter directamente proporcional à cor ou fluorescência emitida. Desta forma, os genes repórter são instrumentos muito importantes para o estudo de sequências reguladoras de transcrição, seja estudo de um promotor ou identificação de elementos cis.

 

Footprinting

O objectivo da técnica de footprinting é identificar zonas do DNA que interactuam com proteínas. Para isso, marca-se radioactivamente uma das extremidades do DNA (para orientar a análise electroforética posterior), e adiciona-se DNAse que corta o DNA em locais não específicos. Como o local onde a proteína se encontra ligada está protegido do corte desta enzima, quando se efectuar uma electroforese e autorradiografia dos fragmentos formados, a zona de interacção DNA- proteína não apresentará fragmento. Por comparação com uma autorradiografia desse DNA sem proteína é possível verificar exactamente onde se dá a ligação.

 

Mapeamento por nuclease S1 e primer extension

Na técnica de mapeamento por nuclease S1 é possível analisar a extremidade 5’ e 3’ do transcrito enquanto no primer extension apenas se analisa a extremidade 5’. Na primeira, constrói-se sondas de cDNA de maneira à extremidade 5’ estar marcada radioactivamente e a terminar dentro do primeiro exão do gene e a extremidade 3’ terminar para além do suposto início da transcrição. De seguida, junta-se o RNA celular e adiciona-se a nuclease S1 que digere fragmentos de ácidos nucleicos em cadeia simples. Analisa-se por electroforese e autorradiografia e o tamanho da secção da sonda localiza a extremidade do transcrito. Na segunda, desenha-se e marca-se um primer complementar ao transcrito que híbrida perto da extremidade 5’. Pela acção da transcriptase reversa, nucleótidos são adicionados ao primer até ao fim da região 5´ do transcrito. A análise é efectuada d mesma forma do mapeamento por nuclease S1. Assim, as duas técnicas são utilizadas em conjunto para identificar o início da transcrição sem ambiguidades.

          


Ensaio de retardação em gel

O ensaio de retardação em gel permite analisar zonas de DNA ou RNA que se ligam a proteínas. O princípio do método baseia-se no retardamento na corrida de electroforese do gel de poliacrilamida quando o ácido nucleico (marcado radioactivamente) se encontra ligado a uma proteína. Comparando experiências em que não são adicionadas proteínas é possível verificar a zona onde estas se ligam. Este estudo é importante par estudar elementos cis, por exemplo.
        

 Yeast-2-hybrid e imunoprecipitação

As técnicas de yeast-2-hybrid e de imunoprecipitação permitem a análise da interacção entre proteínas. No sistema 2-hybrid, utiliza-se como ferramenta os factores de transcrição que possuem dois domínios, um de ligação (binding-domain, BD) e outro de activação (activation domain, AD). Neste caso, funde-se o BD (que se encontra ligado a um gene repórter) com a proteína conhecida e vai-se adicionando diferentes cDNA’s de uma biblioteca que se encontram fundidos com diversas proteínas. Para o factor de transcrição promover a transcrição necessita do domínio BD e AD ligados. Desta forma, é possível identificar a proteína que interactua com a proteína em estudo pois neste ponto há transcrição do gene à qual o BD se encontrava ligado inicialmente, pois BD ligou-se a AD. Esta transcrição é possível de visualizar pois geralmente o gene em questão é um gene repórter. Na técnica de imunoprecipitação, adiciona-se o anticorpo que se vai ligar à proteína em estudo, formando um complexo que contém essa proteína e as que estão associadas, analisando-se de seguida os resultados por electroforese.
            

 
  ENGENHARIA GENÉTICA  
 
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Disciplina de Biotecnologia