O estudo genómico de tantas espécies ao longo do tempo, levou à necessidade da construção de bibliotecas de DNA. Estas são colecções de fragmentos de DNA de um organismo, clonados em vectores, geralmente vírus ou plasmídeos, e armazenadas em células hospedeiras (E. coli). A denominação destas bibliotecas varia conforme a natureza do DNA, ‘biblioteca de DNA genómico’ ou ‘biblioteca de cDNA’. Em ambos os casos o DNA é bastante complexo surgindo a necessidade de produzir um número elevado de clones para assegurar que se obtém todas as partes do genoma.
A organização do DNA em bibliotecas facilita o trabalho da Engenharia Genética pois por vezes é o único modo de se obter um gene, a fim de se efectuar um certo estudo.
Biblioteca de DNA genómico
A biblioteca que inclui fragmentos representativos da totalidade do genoma de uma célula ou organismo é designada por biblioteca genómica. Nesta biblioteca estão presentes não só as regiões codificantes mas também as regiões não codificantes. Desta forma, quando se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da transcrição, por exemplo, recorre-se a este tipo de biblioteca.
De uma forma geral, os passos necessários à construção de uma biblioteca genómica são:
- Isolamento de DNA de alto peso molecular;
- Digestão do DNA isolado com enzimas de restrição de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vector de clonagem;
- Ligação desses fragmentos ao vector, geralmente baseado no fago l;
- Introdução do DNA recombinante nas células hospedeiras de E. coli.
Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening, ou seja, utilizando sondas de DNA, identifica-se e selecciona-se os clones que contêm o fragmento de interesse.
Bibliotecas de DNA complementar (cDNA)
A enzima transcriptase reversa é capaz de sintetizar DNA a partir de mRNA. Desta reacção, surge o cDNA que é constituído apenas pela parte codificante, uma vez que o mRNA só contém os exões. Assim, a sua utilização na área da biotecnologia trouxe muitas vantagens como a possibilidade de cDNAs de células eucarióticas superiores serem directamente transcritos e traduzidos em microorganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios ou a determinação directa da sequência de RNA e subsequente dedução da sequência de aminoácidos da proteína por ele codificada, importante para a sequenciação. Com a utilização crescente deste tipo de DNA surgiu a necessidade de organizar esta informação em bibliotecas, da mesma forma que se fez para o DNA genómico.
A construção de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas:
- Extracção do RNAm total da célula de interesse;
- Síntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e conversão das moléculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela polimerase;
- Introdução dos cDNA recombinantes nos vectores e estes nas células hospedeiras;
- Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones recombinantes.
Tal como nas bibliotecas de DNA genómico, quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening. Neste caso, se a sequência for conhecida utiliza-se sondas de DNA, se não utiliza-se anticorpos (se cDNA estiver num vector de expressão). Depois identifica-se e selecciona-se os clones que contêm o fragmento de interesse.
