Engenharia Genética - Sequenciação de DNA

As áreas de estudo onde a sequenciação de DNA está implícita são inúmeras. Desde a medicina forense até à investigação de genes de interesse na área da biomedicina e agroalimentação, passando por diagnósticos em microbiologia, virologia e oncologia, as possibilidades que esta tecnologia permite, têm demonstrado cada vez mais potencial.

O objectivo da sequenciação é determinar a sequência exacta dos nucleótidos constituintes do DNA. Nos últimos anos tem-se vindo a sequenciar o genoma completo de diversos organismos, uma ferramenta importantíssima para o avanço das ciências biológicas.

O método mais conhecido foi desenvolvido por Sanger et al, na década de 70 e consiste na preparação de quatro tubos de ensaio que diferem apenas no tipo de didesoxirribonucleótido (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) adicionado. Estas moléculas encontram-se truncadas no grupo 3´OH, impedindo a adição de outros desoxirribonucleótidos. Como é possível verificar na imagem, a sequenciação ocorre por análise electroforética dos fragmentos resultantes. Assim sendo, é necessário uma electroforese de alta resolução que permita resolver fragmentos que difiram de um único nucleótido.

Como outras técnicas da biologia molecular, a sequenciação tem vindo a sofrer modificações a fim de facilitar e melhorar a sua utilização. Actualmente, o processo descrito por Sanger é utilizado de diferente modo pois os quatro didesoxirribonucleótidos são marcados com fluorcromos diferentes. Após a reacção, efectua-se uma electroforese e excita-se os fluorocromos com um laser. O sinal emitido por estas moléculas é amplificado e detectado por tubos fotomultiplicadores ou câmaras CD. Este avanço permite a realização da reacção apenas num tubo e uma análise dos resultados menos morosa e mais rigorosa.