O conhecimento de cada vez mais enzimas de restrição e a informação obtida pelos mapas de restrição são ferramentas importantíssimas no desenvolvimento da Engenharia Genética, incluindo na clonagem molecular in vivo. Depois de se amplificar o fragmento por PCR, estudando o seu mapa de restrição juntamente com o mapa do vector, é possível escolher enzimas de restrição que originarão extremidades compatíveis. Adicionando de seguida outra enzima, a ligase (catalisa a ligação covalente fosfodiéster entre dois nucleótidos), promove-se a ligação entre o fragmento e o vector obtendo-se DNA recombinante que será posteriormente inserido em microrganismos a fim de efectuar a clonagem.
Vectores de Clonagem
O passo a efectuar após a digestão enzimática tanto do fragmento como do vector é a inserção do primeiro no segundo. Nesta etapa existe uma série de pontos a ter em conta devido à diversidade de tipos e aplicações dos vectores.
Tal como nas enzimas de restrição, a descoberta dos vectores possibilitou um grande avanço na área da Engenharia Genética. Os vectores são moléculas de DNA que servem de veículo de transporte do fragmento de interesse para as células hospedeiras e que possui certas características que permitirão uma clonagem de sucesso. Dessas características destacam-se:
- Capacidade de se auto-replicar e assim aumentar o número de cópias do vector e consequentemente do gene;
- Tamanho relativamente pequeno, aumentando desta forma a probabilidade de inserção do vector na célula hospedeira;
- Presença de um marcador selectivo que permita a distinção das células transformadas;
- Facilidade de recuperação a partir da célula hospedeira.
Como se referiu anteriormente, existem diferentes tipos de vectores, com diferentes capacidades e finalidades. Os mais relevantes são os plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos, YAC’s e BAC’s e de seguida abordar-se-á cada um em particular.
Plasmídeos
Os Plasmídeos são moléculas de DNA circular extracromossómico proveniente de bactérias. Estes vectores são utilizados quando se pretende clonar genes ou fragmentos de DNA específicos, devendo ter uma série de características que lhes permite desenvolver a sua função. Entre elas podem-se diferenciar a presença de uma origem de replicação (daí possuírem replicação autónoma), marcas genéticas que lhes permitem ser seleccionados dependendo do meio em que estão inseridos e um local de clonagem múltipla (MCS). Esta região contém sequências de corte para diversas enzimas de restrição, facilitando a introdução do DNA no plasmídeo, aumentando a utilização deste vector, uma vez que desta forma pode ser manipulado por diferentes enzimas.
Bacteriofagos
Os bacteriófagos são muitas vezes denominados por “Fagos” e consistem num pequeno vírus que infecta exclusivamente bactérias. Normalmente os fagos utilizados em clonagem molecular derivam do fago λ e dependendo da acção que este terá na bactéria é designado por lítico ou lisogénico. O que distingue estes dois tipos de fagos é a lise celular da bactéria infectada. No ciclo litíco o fago ao reproduzir-se provoca a morte da bactéria, enquanto no ciclo lisogénico o DNA do fago é integrado no DNA da bactéria replicando-se em conjunto, sem haver a lise da mesma. O tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende clonar permite ainda diferenciar dois tipos de fagos. Caso o fragmento de DNA tenha cerca 15 kb o fago é denominado de inserção, caso tenha entre 20-25 kb é denominado de substituição.
Cosmídeos
Este tipo de vector resulta da hibridação de plasmídeos com fagos (fagos λ), ou seja, são plasmídeos que apresentam os locais cos das extremidades do fago λ. Estes são importantes na ligação do fragmento de interesse digerido com as enzimas de restrição às moléculas fágicas. Os cosmídeos permitem a clonagem de fragmentos de DNA maiores, superiores a 45 kb, sendo importante para a clonagem de genes eucariotas que são significativamente maiores.
YAC’s (Yeast artificial chromosome)
Este vector é descrito como um cromossoma artificial uma vez que possui sequências centroméricas, assim como sequências teloméricas. Estas permitem a replicação do vector, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YAC’s são normalmente utilizados para clonar grandes fragmentos de DNA (100 a 2000 kb), não podendo esquecer que os seus hospedeiros são como o próprio nome indica leveduras.
Um outro tipo de vector utilizado neste tipo de clonagem é designado de BAC’s, tendo como única diferença o organismo hospedeiro, que neste caso são bactérias.
Vectores shuttle
Os vectores shuttle, em português vai-vem, são, como o próprio nome indica, vectores (geralmente plasmídeos) que conseguem replicar em mais que um hospedeiro, sejam diferentes espécies de bactérias ou eucariotas e procariotas. Esta característica é vantajosa uma vez que permite a manipulação genética num certo organismo de fácil manuseamento e depois a transferência do produto final para outro organismo de mais difícil ou morosa utilização.
Vectores de expressão
Apesar do vector de expressão se encontrar junto dos vectores descritos anteriormente, possui características e finalidades um pouco diferentes. Este tipo de vector não permite apenas aumentar o número de cópias de um determinado fragmento genético, tal como os vectores de clonagem, mas também obter o produto desse fragmento clonado. Assim, para além do que foi dito para os vectores de clonagem, o vector de expressão deve apresentar:
- Promotor forte e eficiente para produzir elevadas quantidades da proteína desejada e de baixo nível basal para evitar toxicidade;
- Terminador a fim de evitar a trascrição não desejada;
- Sequência Shine-Dalgarno para o inicio da tradução (no caso de procariotas);
- Tags e proteínas de fusão para permitir a purificação das proteínas de interesse e adicionar características vantajosas;
- Protease cleavege site para remover os tags;
- Repressor para evitar a produção de proteína em quantidades tóxicas;
- Sequência de um péptido sinal para uma secreção correcta da proteína.
Transformação e identificação dos transformantes
Após a formação do DNA recombinante, é necessário introduzir esta molécula em células hospedeiras, geralmente bactérias ou leveduras, afim de incentivar a sua amplificação (transformação). Para além do vector se auto replicar, sempre que a célula se reproduz, multiplica o número de moléculas recombinantes.
A inserção do DNA recombinante em células hospedeiras pode ser efectuada de diferentes maneiras. Uma delas é denominada por transformação clássica e consiste na formação de células competentes. Para isso, é efectuado um tratamento com cloreto de cálcio antes da transformação. Normalmente, a carga negativa do DNA (devido ao fosfato) é repelida pela carga negativa da membrana das bactérias (devido aos fosfolípidos), assim, o ião Ca 2+ neutraliza estas forças, facilitando a entrada do DNA de interesse nas bactérias. Outro método utilizado, mais eficaz que a transformação clássica é a electroporação que se baseia na electropermeabilização reversível, das células bacterianas, devido a um impulso eléctrico de elevada intensidade e curta duração. É importante descrever ainda o método de transdução, onde as bactérias hospedeiras são infectadas por vírus (que contêm o fragmento de interesse) de forma controlada, em laboratório.
Depois de se introduzir o DNA nas células hospedeiras, é necessário verificar aquelas que possuem o vector com o fragmento. Para isso, deixam-se as células a crescer num meio selectivo, ou seja, num meio que possua alguma característica que permita a identificação das células de interesse. Geralmente, os plasmídeos (vectores) possuem um ou mais genes de resistência a antibióticos. Desta forma, inserindo o fragmento a meio de um desses genes, interrompendo-o (A) e deixando outro intacto (B) e juntamente, criando uma série de controlos, é possível efectuar a identificação. Assim,
a) As células que não crescerem no meio com o antibiótico A nem no meio com antibiótico B não possuem o vector;
b) As células que crescerem no meio com o antibiótico A e no meio com antibiótico B possuem o vector mas sem o fragmento, provavelmente houve recircularização;
c) As células que não crescerem no meio com o antibiótico A mas crescerem no meio com antibiótico B, possuem o vector com o fragmento.
A inserção do fragmento a meio de um certo gene é escolhida com base, uma vez mais, no mapa de restrição do fragmento e do vector.
Outra forma de seleccionar as células com o fragmento de interesse é similar à anterior, mas neste caso, o gene interrompido codifica para uma certa enzima. As células que não expressarem a enzima, contêm o fragmento.
Etapas da clonagem in vivo
Em suma, os passos essenciais para efectuar a clonagem de um gene num vector são:
- Isolamento do DNA genómico;
- Desenho dos primers;
- Amplificação por PCR;
- Digestão enzimática do DNA do vector e do fragmento;
- Ligação do fragmento ao vector- DNA recombinante;
- Introdução do DNA recombinante nas células hospedeiras - transformação;
- Selecção e identificação dos clones recombinantes.
