PCR (Polimerase Chain Reaction)

Em 1983 o bioquímico Kary Mullis, desenvolveu uma técnica que revolucionou várias áreas das ciências biológicas que denominou de PCR e que lhe valeu mais tarde o Prémio Nobel da Química. De facto, com esta tecnologia, a amplificação de um fragmento genético tornou-se muito mais fácil e rápida. Basicamente, é possível replicar uma sequência de DNA especifica a partir de um conjunto heterogéneo de moléculas de DNA.

A reacção ocorre num aparelho denominado por termociclador, que tem como principal objectivo variar a temperatura ao longo do tempo. Devido às suas propriedades, com a alteração da temperatura o DNA altera a sua conformação e estrutura permitindo o progresso da reacção.

A amplificação dá-se em três passos que vão sendo repetidos ao longo de cerca de trinta ciclos:

1) Desnaturação da cadeia molde (95ºC) – o DNA que se pretende amplificar tem que estar em cadeia simples de maneira a permitir o emparelhamento dos primers;

2) Emparelhamento dos primers (64ºC)- é este passo que permite a amplificação de um fragmento a partir de um conjunto heterogéneo de moléculas de DNA pois os primers adicionados  são oligonucleótidos específicos para a sequência de interesse, necessários à função da polimerase;

3) Extensão de novas cadeias pela polimerase (72º) - a polimerase tem que ser termoresistente para sobreviver às variações de temperatura. Neste passo a enzima liga-se aos primers e prolonga a cadeia adicionando nucleótidos a partir desse ponto.

Após os primeiros ciclos, o produto amplificado com o tamanho fixo esperado começa a predominar. Como todas as tecnologias tem vantagens e desvantagens que necessário considerar.

Vantagens:

• Rapidez , simplicidade e baixo custo- obtenção de produto em algumas horas;
• Sensibilidade e rigor- amplifica DNA de apenas uma célula;
• Robustez e especificidade - graças à utilização de primers consegue-se amplificar um fragmento especifico de DNA mesmo que este esteja contaminado com outros materiais ou DNA degradado.

Desvantagens:

• Necessidade de alguma informação sobre a sequência nucleotídica do fragmento que se pretende amplificar para poder desenhar os primers;
• Facilidade de contaminação devido à elevada sensibilidade;
• Limite no tamanho do produto amplificado (5kb);
  
• Incorporação errónea de bases durante a replicação (taq polimerase não tem actividade proofreading).